維甲酸與基因表達

 

全反式維甲酸(RA, ATRA)是一種多效激活因子，負責調(diào)節(jié)與正常脊椎動物細胞分化、細胞增殖、凋亡和胚胎發(fā)育等過程相關(guān)的基因。維甲酸及其作為激活配體的受體蛋白是眾多分析維甲酸介導(dǎo)基因表達的研究熱點。目前的技術(shù)，包括siRNA敲除特定基因，RT-PCR評估基因表達，染色質(zhì)免疫沉淀，已經(jīng)成為擴展經(jīng)典RA信號通路認知的關(guān)鍵。 
 

維生素A (全-反式-維甲酸)及其酯是功能性RA的前體，而胡蘿卜素，特別是β-胡蘿卜素，是由植物合成的維生素A前體（詳見圖 1、2、3）。類維生素A這一術(shù)語既包括結(jié)構(gòu)上與維生素A有關(guān)的化合物，也包括具有生物維生素A活性的化合物。動物通過代謝飲食中的胡蘿卜素生成脂溶性類維生素A，并將類維生素A主要儲存在肝臟中；動物不能通過其他機制合成類維生素A。胡蘿卜素存在于幾種食用植物中，包括黃色、紅色或深綠色的蔬菜，以及紅色或黃色的非柑橘類水果。人類主要的動物性維生素A飲食來源包括肝臟、魚類和魚油，如金槍魚、沙丁魚和鱈魚的魚油。在美國，乳制品通常補充維生素A和維生素D。維生素A攝入后與視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)結(jié)合，用于血漿運輸和細胞攝取。β-胡蘿卜素和維生素A酯成為乳糜微粒殘留物的伴侶后，經(jīng)轉(zhuǎn)運被細胞表面受體吸收。1

 

 

細胞內(nèi)維生素A水平由細胞視黃醇結(jié)合蛋白(CRBPs)和細胞視黃酸結(jié)合蛋白(CRABP-I和CRABP-II)維持。2CRBP與視黃酸酯的儲存和運輸有關(guān)，而CRABP則是視黃酸的伴侶。活性類維生素A的內(nèi)源性濃度是至關(guān)重要的，并處于嚴密的體內(nèi)平衡控制下，因為類維生素A水平過高或缺乏均可致畸。2 

 

β-胡蘿卜素通過酶促氧化裂解β-胡蘿卜素15,15 '-單氧化酶(EC 1.14.99.36)，從而形成視黃醛的兩個分子。3,4 β-胡蘿卜素15,15 '-單氧化酶的基因已經(jīng)確認與各種各樣的物種有相當數(shù)量的同源性，包括人類、小鼠、雞、斑馬魚、果蠅、和藍藻魚腥藻和聚球藻種。

 

維生素A及其酯通過兩步氧化過程轉(zhuǎn)化為維甲酸及相關(guān)化合物。視黃醇在視黃醇脫氫酶(EC 1.1.1.105)或其他醇脫氫酶的作用下被氧化成視黃醛。視黃醛隨后被視黃醛脫氫酶(EC.1.2.1.36)氧化成RA。2 細胞維甲酸結(jié)合蛋白I (CRBP-I)作為維甲酸和視黃醛的伴侶，通過氧化酶促進其代謝。

 

類維生素A核受體蛋白

視黃酸受體(RAR)和視黃酸X受體(RXR)是參與視黃酸介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的兩個核受體蛋白家族。5 這些受體蛋白是類固醇/甲狀腺/維甲酸核受體核轉(zhuǎn)錄家族的成員。這些核受體結(jié)合在一起，能夠轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)數(shù)百個基因。RAR和RXR各有三個同位型，分別為α、β和γ。盡管每個RAR同位型的基因序列與另外兩個同位型有很大的差異，但每個同位型的基因序列在人和小鼠之間高度保守，因此推測每個RAR同位型具有其特定的功能。6除了這三種同位型外，RAR和RXR都被發(fā)現(xiàn)作為多種同位型存在，這些同位型是由一個主要轉(zhuǎn)錄本的選擇性剪接或啟動子使用差異造成的。7

RAR和RXR受體蛋白的單體形式無活性。RAR自身不形成同源二聚體，而是與RXR形成異源二聚蛋白(RAR:RXR)。該RAR:RXR蛋白復(fù)合物是維甲酸信號的主要受體復(fù)合物。除了與RAR形成異源二聚體外，RXR還能與包括PPAR在內(nèi)的其他受體蛋白進行二聚化。5 

 

RAR:RXR蛋白復(fù)合物與維甲酸反應(yīng)成分(RREs)或類維甲酸X反應(yīng)成分(RXREs)結(jié)合，每個反應(yīng)成分都是成分明確的DNA序列。7 RXR增強了RAR蛋白與RARE序列的結(jié)合。5在配體受體結(jié)合位點缺乏配體的情況下，apo-RAR:RXR異源二聚體會集合干擾轉(zhuǎn)錄過程的輔抑制物、蛋白質(zhì)和酶。8核受體輔抑制物(NCoR)和視黃酮和甲狀腺激素受體(SMRT)的沉默介質(zhì)通過結(jié)合RAR和RXR的配體結(jié)合域抑制轉(zhuǎn)錄。隨后結(jié)合含有組蛋白去乙酰化酶活性(HDACs)的蛋白復(fù)合物，這些酶在核小體內(nèi)對組蛋白去乙酰化。乙?；娜コ黾恿私M蛋白尾部的正電荷，從而增加了組蛋白對帶負電荷的染色質(zhì)的吸引力。結(jié)果是染色質(zhì)變得更加緊密，限制了轉(zhuǎn)錄因子附著在基因起始位點的能力，限制或阻止了轉(zhuǎn)錄 (見 圖4）。9 

 

 

RA和9-順-維甲酸 (9-反-RA)與RAR的配體受體結(jié)合位點有很強的親和力。9-順RA對RXR的配體結(jié)合位點有很強的親和力,但RA不是RXR的配體。盡管9-順RA在體外表現(xiàn)出對RXR的特異性，但是并沒有證據(jù)表明9-順RA是體內(nèi)RXR活化的實際配體。1

如果配體附著在RXR的配體結(jié)合區(qū)域，其構(gòu)象的改變不足以克服輔抑制物的集合。該無法激活RXR以啟動受體通路現(xiàn)象被稱為RXR從屬或apo-RAR沉默。5,10或者，當RA或另一種類視黃素結(jié)合至RAR配基的配體結(jié)合區(qū)域時，蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化足以使募集到的輔抑制復(fù)合物轉(zhuǎn)化為輔活化物。如果RAR和RXR的結(jié)合域都有配體，則蛋白復(fù)合物的折疊性增強。RA通過CRABP-II從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核，CRABP-II將RA作為伴侶蛋白轉(zhuǎn)運至RAR:RXR異源二聚體的RAR域的配體受體結(jié)合位點。11 

 

維甲酸介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄經(jīng)典途徑

RA調(diào)控基因表達的經(jīng)典途徑有四個特定的步驟，盡管這些步驟的順序并不是對所有基因都相同。7,8 RA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄被定義為12：

• RA或其他類維生素A配體與配體結(jié)合位點的結(jié)合

• 受體二聚化(RAR:RXR二聚化)

• 受體異源二聚體與DNA (RAREs)結(jié)合

• 通過染色質(zhì)重構(gòu)和轉(zhuǎn)錄機制的募集，對基因進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控

DNA結(jié)合直接受修飾核小體染色質(zhì)結(jié)構(gòu)并使轉(zhuǎn)錄機制進入基因啟動子區(qū)域的輔激活物和輔抑制物的作用影響。

 

一旦類維生素A的結(jié)合修飾了RAR:RXR復(fù)合物，輔抑制物即與復(fù)合物分離，并募集輔激活物。轉(zhuǎn)錄機制復(fù)合體必須進行染色質(zhì)重構(gòu)后才能獲得待轉(zhuǎn)錄的基因。類固醇受體輔激活物(SRC)蛋白和具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)活性的p160蛋白可以在配體存在的情況下附著于RAR或RXR的配體結(jié)合域。SRC輔激活物則乙?；疍NA結(jié)合位點附近的核心組蛋白中的賴氨酸殘基，中和組蛋白電荷并減弱與染色質(zhì)的相互作用。染色質(zhì)變得松散，變得更容易參加DNA轉(zhuǎn)錄機。9 

 

ATP依賴的染色質(zhì)重構(gòu)蛋白（如SWI/SNF）利用ATP水解的能量重新定位核小體結(jié)合到基因啟動子區(qū)域，形成無核小體或核小體間隔區(qū)域，為轉(zhuǎn)錄機提供通路。額外的輔激活或輔整合蛋白的一個例子是p300/CRB蛋白。p300/CRB通過募集額外的通用轉(zhuǎn)錄因子至啟動子區(qū)域，并與轉(zhuǎn)錄起始位點的轉(zhuǎn)錄機結(jié)合，在類維甲酸通路中發(fā)揮作用。(見 圖5)。7,8

 

 

染色質(zhì)重構(gòu)后，輔活化子游離出來，可能會被蛋白酶體降解。包含復(fù)合物(SMCC)的SRB和中介隨后被類維生素A受體所吸收。介質(zhì)復(fù)合物促進轉(zhuǎn)錄機制，包括RNA聚合酶II (Pol II)、基因轉(zhuǎn)錄中的關(guān)鍵酶，進入基因啟動子的起始位點。染色質(zhì)重構(gòu)也促進了其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。RA啟動了TNF-α-誘導(dǎo)的與NF-κB的結(jié)合，并與TNF-α協(xié)同作用去招募并刺激與酶活性相關(guān)的Pol II的磷酸化，(見 圖6)。13 

 

基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控

RA影響的生理過程的多樣性可能部分歸因于RAR和RXR受體家族中可能存在的組合和冗余。盡管RARs是啟動類視網(wǎng)膜通路的主要因素，而RXRs除了介導(dǎo)RARE被RARs附著外，還可能對這一過程起協(xié)同作用。5 在一項定性研究中，Balmer和Blomhoff回顧了發(fā)表的532個由RA調(diào)控的基因的數(shù)據(jù)。他們對文獻的分析包括評估哪些基因強有力的證據(jù)證明其被經(jīng)典通路所調(diào)控。12只有27個基因被強烈認為受經(jīng)典通路調(diào)控，其中26個基因上調(diào)，一個基因被可變調(diào)控。不考慮通路，RA上調(diào)的基因數(shù)量為311個；有趣的是，212個基因要么下調(diào)，要么被可變調(diào)控。直接的、經(jīng)典的途徑雖然提供了RA功能一些視角，但并不是RA受影響表達的唯一的方法。

 

RA通路的綜述通常包括泛素化和磷酸化作為下游過程，對基因調(diào)控和轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要。1,7,8泛素化終止類維生素A的信號通路后，RAR/RXR被蛋白酶體降解，因此泛素化可能通過啟動終止過程介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。磷酸化是非常重要的，因為RAR和RXR亞型可以作為激酶底物發(fā)揮作用。磷酸化可能參與蛋白體降解，影響全RAR:RXR復(fù)合物與共調(diào)節(jié)因子和通用轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力。8 磷酸化的絲氨酸殘基RARγ已經(jīng)被證明能夠控制RARγ的反式激活和由蛋白酶體對RARγ的降解。7

 

介質(zhì)蛋白的表達可能為間接調(diào)控轉(zhuǎn)錄提供了一種解釋機制。RA可能通過調(diào)控其他轉(zhuǎn)錄因子而不依賴與RAREs的結(jié)合來調(diào)控基因表達。1 這種間接調(diào)控可以解釋干擾蛋白的調(diào)控和表達導(dǎo)致的目標基因下調(diào)。

 

RIP140是一種輔助抑制蛋白，優(yōu)先與配體附著的RAR結(jié)合，而不是與通常招募輔助抑制蛋白的apo-RAR:RXR復(fù)合物結(jié)合。RIP140抑制多個配體結(jié)合核受體的反式激活功能，并將HDACs招募到RAR:RXR結(jié)合的基因啟動子。RIP140可將HDAC招募到其他蛋白中作為底物使用，或者也可自身作為HDAC的底物發(fā)揮作用。RIP140這種輔抑制物的選擇性結(jié)合被推測為類維生素A信號通路提供一種調(diào)節(jié)基質(zhì)。10,14 最近使用經(jīng)RIP140 siRNA處理的NT2/D1細胞開展的研究發(fā)現(xiàn)，依賴于RA的基因表達水平出現(xiàn)了顯著的變化，而不是不依賴于RA的基因。15 

 

除了RAR和RXR受體家族外，RA還作為過氧化物酶體增殖物激活受體PPARβ/δ的配體，以及誘導(dǎo)細胞生存基因的核受體。11 脂肪酸結(jié)合蛋白5(FABP5)作為轉(zhuǎn)移RA至PPARβ/δ受體的一個伴侶蛋白。RA在核內(nèi)RAR和PPARβ/δ的分配分別由轉(zhuǎn)移蛋白CRABP-II和FABP5調(diào)控，并且FABP5表達增加會使RA向PPARβ/δ的轉(zhuǎn)移增加。21,23 相對于CRABP-II伴侶蛋白的表達濃度，表達高濃度脂肪酸結(jié)合蛋白5 (FABP5)伴侶蛋白的MCF-7細胞，與細胞存活和增殖相關(guān)。11 除了核基因轉(zhuǎn)錄外，RA還被證明可以介導(dǎo)線粒體基因的轉(zhuǎn)錄；雖然這一機制還未明確，但已經(jīng)確立了包括直接和間接的表達途徑的理論。16 

 

由于RXR能夠與包括其他PPAR在內(nèi)的其他核受體形成異源二聚體，因此它可以與PPAR介導(dǎo)的其他信號通路發(fā)生交聯(lián)。7,8 9-順RA可以作為PPAR:RXR的單一激活配體，9-順RA和其他維甲酸(RXR的特異性配體化合物)可以通過激活PPAR:RXR二聚體，不依賴于PPAR配體而啟動PPAR信號通路。7,8 此外，非維生素A原類胡蘿卜素可能會與PPAR受體相互作用，因為PPAR可以被各種親脂分子激活。17 維甲酸已表現(xiàn)出靶向P13K/Akt通路，早期Akt活性增加，但后期Akt活性降低。18 維甲酸影響的其他替代機制可能仍有待發(fā)現(xiàn)。

 

由于有大量基因受RA信號影響，因此內(nèi)源性維甲酸水平對正常發(fā)育至關(guān)重要。極端濃度水平對分化細胞是致畸的，規(guī)定的濃度范圍是正常胚胎發(fā)育所必需的。合成的類維生素A、類維生素A和維甲酸的代謝阻斷劑(RAMBAs)目前正在研究其作為RAR/RXR配體修飾信號，通過細胞色素P450酶(CYPs)阻斷RA代謝，以及提高內(nèi)源性RA水平這幾方面的潛在價值。19,20

 

參考文獻

1.Blomhoff R, Blomhoff HK. 2006. Overview of retinoid metabolism and function. J. J.. 66(7):606-630. http://dx.doi.org/10.1002/neu.20242

2.McCaffery PJ, Adams J, Maden M, Rosa-Molinar E. 2003. Too much of a good thing: retinoic acid as an endogenous regulator of neural differentiation and exogenous teratogen. Eur J Neurosci. 18(3):457-472. http://dx.doi.org/10.1046/j.1460-9568.2003.02765.x

3.Wyss A. 2004. Carotene Oxygenases: A New Family of Double Bond Cleavage Enzymes. 134(1):246S-250S. http://dx.doi.org/10.1093/jn/134.1.246s

4.Lakshman MR. 2004. Alpha and Omega of Carotenoid Cleavage. 134(1):241S-245S. http://dx.doi.org/10.1093/jn/134.1.241s

5.Chambon P. 2005. The Nuclear Receptor Superfamily: A Personal Retrospect on the First Two Decades. 19(6):1418-1428. http://dx.doi.org/10.1210/me.2005-0125

6.Krust A, Kastner P, Petkovich M, Zelent A, Chambon P. 1989. A third human retinoic acid receptor, hRAR-gamma.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86(14):5310-5314. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.86.14.5310

7.Bastien J, Rochette-Egly C. 2004. Nuclear retinoid receptors and the transcription of retinoid-target genes. Gene. 3281-16. http://dx.doi.org/10.1016/j.gene.2003.12.005

8.McGrane MM. 2007. Vitamin A regulation of gene expression: molecular mechanism of a prototype gene. The Journal of Nutritional Biochemistry. 18(8):497-508. http://dx.doi.org/10.1016/j.jnutbio.2006.10.006

9.KISHIMOTO M, FUJIKI R, TAKEZAWA S, SASAKI Y, NAKAMURA T, YAMAOKA K, KITAGAWA H, KATO S. 2006. Nuclear Receptor Mediated Gene Regulation through Chromatin Remodeling and Histone Modifications. Endocr J. 53(2):157-172. http://dx.doi.org/10.1507/endocrj.53.157

10.Wei L. 2004. Retinoids and Receptor Interacting Protein 140 (RIP140) in Gene Regulation. CMC. 11(12):1527-1532. http://dx.doi.org/10.2174/0929867043365017

11.Schug TT, Berry DC, Shaw NS, Travis SN, Noy N. 2007. Opposing Effects of Retinoic Acid on Cell Growth Result from Alternate Activation of Two Different Nuclear Receptors. Cell. 129(4):723-733. http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2007.02.050

12.Balmer JE, Blomhoff R. 2002. Gene expression regulation by retinoic acid. J. Lipid Res.. 43(11):1773-1808. http://dx.doi.org/10.1194/jlr.r100015-jlr200

13.Witcher M, Pettersson F, Dupere-Richer D, Padovani A, Summers-Deluca L, Baldwin AS, Miller WH. Retinoic acid modulates chromatin to potentiate tumor necrosis factor alpha signaling on the DIF2 promoter. Nucleic Acids Research. 36(2):435-443. http://dx.doi.org/10.1093/nar/gkm1058

14.White KA, Yore MM, Warburton SL, Vaseva AV, Rieder E, Freemantle SJ, Spinella MJ. 2003. Negative Feedback at the Level of Nuclear Receptor Coregulation. J. Biol. Chem.. 278(45):43889-43892. http://dx.doi.org/10.1074/jbc.c300374200

15.Heim KC, White KA, Deng D, Tomlinson CR, Moore JH, Freemantle SJ, Spinella MJ. 2007. Selective repression of retinoic acid target genes by RIP140 during induced tumor cell differentiation of pluripotent human embryonal carcinoma cells. Mol Cancer. 6(1):57. http://dx.doi.org/10.1186/1476-4598-6-57

16.Berdanier CD. 2006. Mitochondrial Gene Expression: Influence of Nutrients and Hormones. Exp Biol Med (Maywood). 231(10):1593-1601. http://dx.doi.org/10.1177/153537020623101003

17.Bertram JS, Vine AL. 2005. Cancer prevention by retinoids and carotenoids: Independent action on a common target. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1740(2):170-178. http://dx.doi.org/10.1016/j.bbadis.2005.01.003

18.Bastien J, Plassat J, Payrastre B, Rochette-Egly C. 2006. The phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway is essential for the retinoic acid-induced differentiation of F9 cells. Oncogene. 25(14):2040-2047. http://dx.doi.org/10.1038/sj.onc.1209241

19.Lippman SM, Lotan R. 2000. Advances in the Development of Retinoids as Chemopreventive Agents. 130(2):479S-482S. http://dx.doi.org/10.1093/jn/130.2.479s

20.Njar VC, Gediya L, Purushottamachar P, Chopra P, Vasaitis TS, Khandelwal A, Mehta J, Huynh C, Belosay A, Patel J. 2006. Retinoic acid metabolism blocking agents (RAMBAs) for treatment of cancer and dermatological diseases. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 14(13):4323-4340. http://dx.doi.org/10.1016/j.bmc.2006.02.041

21.Wolf G. Retinoic acid as cause of cell proliferation or cell growth inhibition depending on activation of one of two different nuclear receptors. 66(1):55-59. http://dx.doi.org/10.1111/j.1753-4887.2007.00006.x

22.Perissi V, Rosenfeld MG. 2005. Controlling nuclear receptors: the circular logic of cofactor cycles. Nat Rev Mol Cell Biol. 6(7):542-554. http://dx.doi.org/10.1038/nrm1680

23.Schug TT, Berry DC, Toshkov IA, Cheng L, Nikitin AY, Noy N. 2008. Overcoming retinoic acid-resistance of mammary carcinomas by diverting retinoic acid from PPAR / to RAR. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105(21):7546-7551. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0709981105